metodos de estudo da biologia celular e molecular

UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MOÇAMBIQUE

Faculdade de Ciências de Saúde

Curso de medicina ano propedêutico

Aula 2- método de estudo da BCM

Docente: Joana Januário, Mestranda

TÓPICOS DA AULA

•               Conceito de Microscopia e de Microscópio • Microscópio simples e Microscópio composto

•               Breve Historial da Microscopia:

•               Microscópio de Luz ou Fotónico – Conceito e exemplos

•               Microscópio Electrónico – Conceito e exemplos

•               Constituintes de um Microscópio Óptico e respectivas funções

•               Princípio de Funcionamento de um Microscópio Óptico

•               Unidades de tamanho empregues em microscopia • Poder de resolução & limite de resolução

•               Características das objectivas e Código das cores

•               Principais Componentes do microscópio electrónico deTransmissão

•               Técnicas de Preparação de Material para Análise ao Microscópio: (Fixação, Desidratação, Diafanização, Impregnação, Microtomia e coloração.

•               Corantes ácidos, Corantes básicos e corantes neutros

•               Evolução da Teoria Celular – Breve historial

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                     MÉTODOS DE ESTUDO DA BIOLOGIA CELULAR

De um modo geral as células são estruturas minúsculas e invisíveis ao olho humano, por isso, a sua existência foi desconhecida até à invenção do microscópio.

MICROSCOPIA - Ciência que estuda os métodos, técnicas e as aplicações em que se usa o Microscópio para observação de objetos, seres biológicos e estruturas com dimensões inferiores não visualizados à vista desarmada.

Microscópio Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia. É um instrumento utilizado para ampliar, observar e analisar elementos, estruturas e seres biológicos muito pequenos, dificilmente visíveis ou invisíveis a vista desarmada.

Microscópio = pequeno + observar

Microscópio simples ou Lupa – apenas possui uma lente ou um sistema de lentes centradas;

Microscópio composto – Para além do condensador, possui dois sistemas de lentes centradas: ocular e objectiva, para produzir uma imagem ampliada

O Microscópio é o Principal instrumento da Biologia Celular

Historia da microscopia

Não se sabe exactamente quem inventou o primeiro microscópio já que desde séculos A.C. pedaços de vidros já eram utilizados como lentes. Em 1885 foi encontrada uma lupa de quartzo nas ruínas do  palácio do rei Senaqueribe (708-681 a.C.)

Microscópio simples ou Lupa

• -Instrumento óptico de ampliação mais simples que existe.

•         Dotado de uma única lente ou um sistema de lentes centradas

•         Fornece uma imagem, virtual, direita e maior que o objeto real.

•         Limitado pela qualidade da lente

Galileu Galilei (1564-1642)

Galileu Galilei– Físico e astrónomo responsável pela invenção do telescópio, usando um tubo e duas lentes convexas.

Foi a primeira pessoa a aplicar o telescópio ao estudo dos céus. Descobriu vários fenómenos e corpos celestes imperceptíveis a olho nu.

Em (1564-1642) , Galileu desenvolveu o microscópio por si utilizado para descrever o olho complexo de um insecto, bem como para descrever a textura das folhas.

O primeiro????

O primeiro microscópio óptico composto – séc. XVI

Hans Janssen e Zacharias Janssen (1595), holandêses, fabricantes de óculos - construíram o primeiro microscópio óptico composto com capacidade de aumentar até 9x.

Um simples tubo com lentes  em cada uma das extremidades

Hans e Zacharias Janssen não utilizaram sua invenção para fins científicos

Robert Hooke (1635-1703)

Em 1635, Hooke fabricou um microscópio óptico composto mais aperfeiçoado relativamente ao dos irmãos Jansen.

Realizou várias observações microscópicas de insetos, plumas de aves e escamas de peixes, entre outras.

foi uma importante personalidade do meio científico do século XVII. Escreveu o livro “Micrographia”, onde fez algumas descrições fisiológicas de corpos diminutos com o auxílio de aparelhos por si fabricados.

Robert Hooke (1635-1703)

Sua grande descoberta ocorreu em 1665 quando examinou pedaço de cortiça e comprovou que este tinha perfurações muito pequenas delimitadas por paredes, as quais deu o nome de célula.

Microscópio composto de Hooke (tinha um poder ampliador de 30 vezes) e esquema da secção de cortiça observada

Antonie van Leeuwenhoek - 1632 - 1723)

Foi um comerciante de tecidos, cientista e construtor de microscópios .

A sua perícia no polimento de lentes permitiu-lhe construir um microscópio óptico simples constituído por uma lente biconvexa e com um poder ampliação de mais de 100 x.

Antonie van Leeuwenhoek 1632- 1723: Microscópio simples

Em 1674, Leeuwenhoek fez descobertas significativas, foi um pioneiro na observação e descrição de algumas espécies microscópicas.

Água

Microrganismos,

estagnada,

Hemácias 

sangue e

Espermatozoides

esperma

Embriões

plantas

Robert Brown, botânico escocês (1773- 1858)

Em 1833, R. Brown estudou células vegetais e constatou que a grande maioria tinha uma estrutura interna esférica, a que chamou de núcleo e reconheceu esta estrutura como sendo o componente fundamental das células.

Mathias Schleiden & Theodor Schwann

O botânico Mathias Schleiden (1804-1881) (concluiu que todas as plantas são constituídas de células)

O zoólogo Theodor Schwan (1810-1882), (concluiu que todos os animais são constituídos de células)

Em 1839 Matthias Schleiden e Theodor Schwann propõem as bases da teoria celular e afirmam "todo o ser vivo é formado por células".

1857: Rudolph Kölliker (1817-1905) identificou as mitocôndrias.

1877: Carl Zeiss na Alemanha produz a primeira objectiva objetiva de imersão.

1879: Walther Flemming (1843-1905) descreveu a divisão celular e o comportamento dos cromossomas durante a mitose nas celulas animais.

1881: Retzius e outros histologistas desenvolvem novos métodos de coloração para microscopia.

1882: Koch usou corantes de anilina para corar microoorganismos e identificou a bactéria causadora da tuberculose.

1898: Camillo Golgi, foi o primeiro a identificar o complexo de Golgi utilizando coloração de prata.

1938: Zernicke inventa o microscópio de contraste de fase que permitiu observar com detalhes células vivas não coradas pela primeira vez .

1941: Coons usa corantes fluoorescentes acoplados a anticorpos para detectar antígenos celulares.

vide  mais detalhes: Grandes Temas em Biologia, Volume 1 - Módulo 1 de  Francisco Esteves at all.

Classificação dos Microscópios compostos em função do princípio de iluminação que utiliza

Microscópio de Luz ou Fotónico:

O responsável pela formação e transmissão de imagem é a luz (natural ou artificial).

Microscópio Electrónico – utiliza um feixe de electrões para produzir imagens

ampliadas.

1)      Microscópio De luz (ML) EX.

Ø  óptico (comum) / convencional.

Ø  Contraste de fase

Ø  Polarização

Ø  Fluorescência

Ø  Confocal

2) Microscópio Electrónico (ME) EX.

Ø  Microscópio eletrônico de transmissão (MET)

Ø  Microscópio eletrônico de varredura (MEV)

Os modelos microscópicos variam na forma e no desenho

                         Microscópico monocular                                                                microscópicos binoculares

Constituintes de um Microscópio Óptico composto

Composição mecânica de um microscópio óptico composto

Pé ou base – Constitui a base de suporte de todos os elementos do microscópio. Coluna ou Braço - Serve de suporte à platina e ao revólver, ajuda tambem no transporte do aparelho.

Mesa ou Platina - Onde se fixa a lâmina a ser observada, possui uma janela por onde passam os raios luminosos.

Tubo ou canhão - Serve de suporte ao sistema ocular.

Revólver - Serve de suporte às objectivas e permite a sua mudança.

Parafuso Macrométrico Permite deslocamentos verticas e de maior amplitude a platina, focalização grosseira.

Parafuso Micrométrico- Permite deslocamentos verticais e de menor amplitude a platina, focalização fina.

charriot – permite movimentar a lâmina no plano horizontal

Constituintes ópticos de um microscópio óptico

O componente óptico consiste em 3 sistemas de lentes: (Condensador, Objetivas e Oculares)

Condensador - Conjunto de duas ou mais lentes convergentes que condensam orientam e espalham regularmente a luz emitida pela fonte luminosa sobre o campo de visão do microscópio.

Objetivas- Parte do sistema óptico onde se forma a imagem primaria e ampliada do objecto em observação. A ampliação pode ser de: 10x, 40x, 50x, 90x ou 100x.

Oculares - Sistema de lentes que permitem ampliar a imagem fornecida pelas objetivas. A ocular funciona como uma lupa e forma uma imagem virtual final.

Constituintes ópticos de um microscópio óptico

Objetivas de imersão - são objectivas de maior aumento em que se utiliza óleo de imersão para aproveitar toda a abertura numérica da lente.

Diafragma -colocado abaixo do condensador, regula a intensidade da luz que incide na preparação. lâmpada ou espelho- ( fonte luminosa)

Detalhes:

JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J. Histologia Básica – texto e atlas. 12ª ed. pág. 4

Princípio de Funcionamento do Microscópio Óptico composto

-   A emissão da luz é feita de baixo para cima

-   Uma lâmpada ou espelho trazem a luz da parte inferior do microscópio e esta atravessa o condensador. O condensador projecta o cone de luz sobre a amostra (também designada espécime) que esta sendo examinada no Microscópio. Após atravessar a amostra, esse feixe luminoso, penetra a objectiva. A objectiva projecta uma imagem aumentada para a ocular que novamente a amplia. Por fim, a imagem fornecida pela ocular pode ser percebida pela retina.

No caso de imagens projetadas na retina, a ampliação total é calculada multiplicando-se o aumento da objectiva pelo aumento da ocular.

Detalhes:

JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J. Histologia Básica – texto e atlas. 12ª ed. – pág. 4

Princípio de Funcionamento de um Microscópio Óptico composto

A      imagem            final     observada        será ampliada, virtual  e          invertida          do objecto.

Unidades de tamanho normalmente empregues em microscopia

1  µm (micrómetro) = 10-6 m 1nm (nanómetro) = 10-9 m 1Å (angstrom) = 10-10m 1 µm = 1mm / 1000 1 µ m = 1000 nm 1mm = 1000 µ m 1cm = 10 mm

-   O limite de resolução do olho humano é em torno de 100 µm.

-   O melhor microscópio óptico possui limite de resolução de 0,25 µm. - O m. electrónico possui limite de resolução de 0,0002 µm

Dimensões celulares e subcelulares

Poder de resolução & limite de resolução

• Poder de resolução de um microscópio é a capacidade que um sistema óptico tem de:

–   Separar detalhes

–   Produzir imagens separadas de partículas muito próximas

Na prática o Poder de resolução é expresso pelo limite de resolução, que é a menor distancia que deve existir entre dois pontos para que eles apareçam individualizados.

O que determina a riqueza de detalhes da imagem é o limite de resolução de um sistema óptico.

O melhor microscópio é aquele que tem maior poder de resolução, e não o seu poder de ampliar o tamanho dos objectos.

Limite de Resolução (LR)

O limite e resolução é directamente proporcional ao comprimento de onda e inversamente proporcional a abertura numérica.

Características das objectivas de um MOC.

Estrutura

Uma lente objectiva é formada por lentes múltiplas dentro em um cilindro de metal, chamado barril objectivo.

Ampliação

Um MOC tem normalmente três ou quatro objectivas -- 4X, 10X, 40X e 100X …..

A ampliação total dada ao microscópio é igual ao produto da ampliação da objetiva pela ampliação da ocular.

Características das objectivas – cont.

Por ex. para a objectiva - 40x

•            Abertura numérica (NA = 0.65) - indica o poder de resolução de uma lente

•            160 ou 170 = indica em milímetros o comprimento do tubo óptico

•            0,17 = espessura da preparação com lamela

•            40 X = ampliação da objectiva

•            Código de cor

Exemplos de Microscópios de luz mais utilizados:

Para alem do M. (óptico (comum) / convencional.

Ø   Contraste de fase

Ø   Fluorescência

Ø   Confocal

Ø   Polarização

Microscopia de contraste de fase 

A microscopia de contraste de fase é baseada no facto de que a luz muda sua velocidade ao atravessar estruturas celulares e extracelulares que tenham índices de refracção diferentes.

Com base nas mudanças no índice de refracção produz-se imagens de alto contraste e permite a observação de amostras sem coloração prévia.

O m.c.f usa um sistema de lentes que produz imagens visíveis de objetos quase transparentes e, é empregado em especial para o estudo de células vivas e cultivadas, cujo crescimento e a divisão mitótica podem ser facilmente seguidas sem o emprego de corantes.

microscopia de fluorescência (utiliza radiação UV ou luz de mercúrio)

Quando algumas substâncias são irradiadas por luz de certo comprimento de onda, elas emitem luz com um comprimento de onda mais longo. Este fenômeno é a fluorescência.

Algumas estruturas encontradas nas células fixam corantes fluorescentes e, quando são irradiadas com luz ultravioleta emitem luz na porção visível de espectro, fazendo com que as substancias fluorescentes apareçam brilhantes.

O DNA e RNA, CLOROFILA) são exemplos de substâncias capazes de fixar substâncias (corantes) fluorescentes.

Aplicações / microscopia de fluorescência

Tarefa: Substancia larga usada como corante fluorescente:

microscópio confocal – utiliza raios laser

•         O microscópio confocal funciona associado a sistemas computadorizados de grande capacidade de análise de imagem.

•         Permite visualizar imagens de vários planos do mesmo objecto (espécime). Deste modo, possibilita a criação de imagens tridimensionais.

•         Funciona com raios laser que visualizam um único plano de cada vez, de modo a não haver sobreposição de imagens

Microscópio electrónico

O primeiro microscópio electrónico foi construído em 1931/1932 por Ernst Ruska e colaboradores. Este aparelho possui um poder resolutivo muito maior, contribuiu para o avanço da biologia celular e molecular, continuando assim o conhecimento iniciado por Hooke.

Microscópio Electrónico.

No microscópio electrónico a luz é substituída por um feixe de electrões que se propaga no vácuo. Este microscópio não utiliza lentes ópticos (de vidro), mas lentes magnéticas, do que resulta uma ampliação e um poder de resolução muito maior.

Principais Componentes do microscópio electrónico Transmissão

O      trajecto            dos      electrões          ocorre  de        cima     para     baixo   As        lentes   são electromagnéticas

Uma fonte de alta tensão fornece energia para deslocar os electrões do cátodo para o ânodo.

O condensador (condensa) e direcciona os electrões num trajecto linear para a amostra.

A lente objectiva recebe os electrões, forma-se uma imagem ampliada do objecto, a qual é projectada nas outras lentes que por sua vez ampliam a imagem ainda mais.

Por fim, a lente projectora emite a imagem final para um detector, que pode ser uma placa fotográfica ou tela fluorescente para que esta seja perceptível pela retina do olho humano.

Imagem resultante = em preto e branco

Tarefa: procurar imagem - JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO,

J. Histologia Básica –12ª ed. – pág. 7

Comparacao entre microscópio MOC e MET

Característica	Microscópio óptico composto	Microscópio eletrónico de Transmissão
Portátil	Sim	Não
Aumento	2.500X	500.000X
Tamanho mínimo observável	120nm	1nm
Fotografia	Preto, branco e colorido	Preto e branco
Observação ao vivo	Sim	Não

TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE MATERIAL PARA ANÁLISE

AO MICROSCÓPIO

Além do uso de microscópio, o desenvolvimento da BCM esteve directamente relacionado com o desenvolvimento de técnicas de Preparação de material para análise ao microscópio.

A preparação de lâminas histológicas permanentes - é o método mais utilizado.

A preparação de lâminas histológicas segue os seguintes passos:

colecta, fixação, desidratação, diafanização, impregnação, microtomia, colagem do corte à lâmina, coloração e montagem.

Preparação de material para análise ao microscópio

1- Colecta e Fixação – Preserva a morfologia          e          composição     do        tecido utilizando-se          calor,   frio      ou        produtos químicos chamados de fixadores, Ex: o aldeído glutárico.

Função           →        impedir            a          autólise            ou degradação bacteriana        do          material biológico a ser analisado.

2- Desidratação

Desidratação - Retirada da água presente nos tecidos através de sucessivos banhos em uma Bateria de álcool etanol (70%80%-90%-100%).→ o tempo vai depender do material e do material de inclusão.

3 - Diafanização

clarifica o material, tornando-o translúcido. Substituição do etanol por líquido miscível (geralmente xilol).

4-Impregnação

inclusão ou embebição - proporciona

uma consistência rígida a amostra.

Os agentes de impregnação: parafina derretida (habitualmente para a M/óptica) ou resina sintética para (M/ electrónica).

5-Microtomia

No final da impregnação, obtém-se um bloco com tecido no seu interior, que é cortado com o uso do micrótomo em um processo chamado de microtomia.

O Micrótomo - corta finas fatias do tecido (1 a 10µm de espessura).

Tarefa: O que é um criostato?

6-Colagem

7-coloração

Coloração para Microscopia Óptica

A maioria dos tecidos em cortes histológicos são incolores e transparentes. A coloração torna evidentes os vários componentes dos tecidos e das células.

Normalmente são utilizados corantes hidrossolúveis, sendo necessário, deste modo, a remoção da parafina da peça que foi preparada nas etapas descritas anteriormente e que permanece na lâmina de vidro.

coloração

Existem muitos tipos de corantes, mas na sua maioria se comportam como ácido ou base.

•       Corantes ácidos – coram estruturas celulares acidófilas, Ex: de Corantes ácidos

Eosina, orange G, fucsina ácida, Ácido Periódico Schiff (PAS)……

•       Corantes básicos - coram estruturas celulares basófilas, Ex de Corantes básicos:

Azul de Metileno, Azul de Toluidina, Hematoxilina, Orceína, lugol, violeta de genciana ….

•       os CORANTES NEUTROS - Tingir estruturas que não revelam acidofilia nem basofilia. Ex: Vermelho neutro.

coloração

Componentes celulares basofilos

Components celulares acidofilos

-               Núcleo → Ac. Nucleicos ( DNA e

-               mitocondrias,        granulos           de

RNA)

                                                                                                                                      secreção,              proteínas

-               Citoplasma → glicoproteínas citoplasmaticas, e colageno acidas,  carboidratos e  glicosaminas.

Hematoxilina / Eosina (HE) - Coloração frequentemente utilizada

A hematoxilina é uma base, cora em azul ou violeta o núcleo e outras estrut. ácidas como porções do citoplasma ricas em RNA e matriz da cartilagem hialina.

A eosina é um ácido que cora o citoplasma e o colágeno em cor de rosa.

Evolução  da Teoria Celular

Matthias Jakob Schleiden e Theodor Schwann – os fundadores da   Teoria Celular

Em 1837 o botânico Schleiden estudou diversas amostras de plantase e, foi o primeiro a reconhecer que todas as plantas eram formadas a partir de microunidades ou células.

Em 1939, o zoologista Theodore Schwann estendeu essa ideia para os animais.

Epara dowload desta aula clica: m 1839 Schleiden e Schwann promoveram as noções da célula como a unidade básica do organismo e de que cada célula individual contém todas as características essenciais à vida.

Evolução  da Teoria Celular

Robert Remak (1815-1865), alemão afirma que as células surgem por divisão celular, começando pela divisão dos núcleos.

Rudolf Virchow, alemão, fundador da patologia celular. Em 1845 demonstrou que a teoria celular se aplica tanto aos tecidos doentes quanto aos saudáveis. Ou seja, que as células doentes derivam das células sadias de tecidos normais.

Na década de 1850, Robert Remak e Rudolf Virchow, declararam que a células se originavam de outras células pré-existentes. Estas premissas, aceitas pela comunidade científica da época, fortaleceram a Teoria celular formulada por Schleiden e Schwann .

A Teoria celular se sustenta em três grandes pilares:

1°) Todos os seres vivos são formados por células e por estruturas que elas produzem: unidades morfológicas dos seres vivos;

2°) Todas as reações metabólicas ocorrem ao nível celular: é através da célula que toda a energia necessária para o funcionamento do organismo é obtida, convertida, armazenada e aplicada.

3°) Toda célula origina-se de outra pré-existente, da reprodução celular.

FIM